SARSの消毒

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8229 (2023) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

UV 照射は、ウイルス全般、特にコロナウイルスの消毒に効果的なツールです。この研究では、267 nm UV-LED による SARS-CoV-2 変異株野生型 (武漢株に類似) および 3 つの変異型 (アルファ、デルタ、オミクロン) の消毒動態を調査します。すべての変異体は、5 mJ/cm2 でコピー数の平均 5 log を超える減少を示しましたが、特に Alpha 変異体では矛盾が明らかでした。線量を 7 mJ/cm2 に増加しても、平均不活化は増加しませんでしたが、不活化の不均一性が劇的に減少し、この線量が推奨最小値となりました。配列分析により、変異間の違いは特定の UV 超感受性ヌクレオチド配列モチーフの頻度の小さな違いによる可能性が高いことが示唆されていますが、この仮説にはさらなる実験的検証が必要です。要約すると、シンプルな電力需要（バッテリーまたは太陽光発電パネルで動作可能）と幾何学的柔軟性を備えた UV-LED の使用は、SARS-CoV-2 の蔓延の防止に多くの利点をもたらす可能性がありますが、最小限の UV 線量には注意が必要です考慮された。

紫外線 (UV) 照射の効率は、UV 線量、放射照度、照射源、微生物と菌株の種類、マトリックス、UV 波長などの複数の要因に依存します。 UV 発光ダイオード (UV LED) は、比較的狭い半値全幅 (FWHM) 帯域幅を持つ特定の波長で UV 光を放射します。たとえば、殺菌範囲の UV LED または多色水銀の波長は、より高い UV 波長では有効性が低くなります 1,2 が、異なる波長の UV LED と UV 損傷メカニズムでは時間と線量の相反則の不一致が見つかりました (参考文献 3;表 2 も参照してください)。

UV 照射は、水溶液 1,4、表面 5,6、空気/バイオエアロゾル 7,8 などのさまざまな環境におけるウイルスの不活化に効果的です。 UV 照射は、ヒトコロナウイルス (hOC431 など) および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV2) の不活化にも効果的であることがわかりました 9,10。しかし、SARS-CoV-2 の流行は変異株の急速な出現を特徴とし 11,12、異なる SARS-CoV-2 変異株に対して行われた研究間の比較が複雑になっています。私たちの以前の研究では、ヒトコロナウイルスの 1 つの株 (hCV-431) に対する UV LED の波長の影響を調べました。今回我々は、SARS-CoV-2の4つの異なる変異体（野生型、アルファ、デルタ、オミクロン）の、ピーク発光が267nmのUV-LED殺菌波長に対する感受性を調べた。

UV-LED スペクトルは、12 nm の狭い FWHM 帯域幅で 267 nm にピーク発光を示しました (図 1)。

この研究で使用した 267 nm UV LED の発光スペクトル。

用量ゼロ (UV 曝露なし) では、さまざまな変異体の初期ウイルスコピー数の間に変動が見つかりましたが、一元配置分散分析では統計的に有意な差は示されませんでした (F3,60 = 0.2941、p = 0.83)。 267 nm UV LED に対するさまざまな SARS-CoV-2 変異体の照射時間と線量 (フルエンス) 応答曲線を図 2 に示します。wt、デルタ、およびオミクロン変異体の最初の統計的に有意な不活化には、2 mJ/cm2 への曝露が必要でした。一方、Alpha バリアントは 5 mJ/cm2 を必要とし (図 2b)、線量が高くなると最大線量 (10 mJ/cm2) までプラトーになります。興味深いことに、不活化効率の変動は、エラーバーのサイズ (図 2) と、特にアルファバリアント (表 1) の大きな変動係数から明らかなように、UV 線量とバリアントの両方に依存していました。低線量でのこの変動は、コロナウイルスを軽減する消毒システムを設計する際に役割を果たすはずであり、7 mJ/cm2 の UV-LED 線量が推奨されます。さらに、この場合、LED 入射放射照度は低かったが、より強力な LED (特定の露光時間でより高い放射束につながる) を使用すると、この変動のリスクを軽減できる可能性があるため、検討する必要があります。

さまざまな SARS-CoV-2 変異体の UV267nm 照射時間と用量反応曲線 (加重入射放射照度 0.152 mW/cm2)。データポイントは平均です (0 ～ 5 mJ/cm2 の場合は N = 11 ～ 16、7 mJ/cm2 以上の場合は N = 4)。エラーバーは 1 SD を示します。

異なる不活化効率の根底にあるメカニズムを解読するために、我々は、それぞれ最高強度の UV 誘発 6-4PP 付加体と CPD 損傷のコンセンサスであるストレッチ YTTC および YCTY (「Y」は C または T) の配列に焦点を当てて変異体の配列をさらに調べました 17 。表2は、異なるバリアントの配列におけるこれらの配列の出現数を報告しており（補足図S1の配列アラインメントを参照）、UVに応答したその高い耐性と分散と一致して、アルファバリアントがそのような配列の出現が最も低いことを示しています。中間の線量 (つまり 2 mJ/cm2) で。この仮説が正しければ、ウイルスのゲノム配列の小さな変化がその紫外線耐性に劇的な変化をもたらす可能性があることを示唆しており、病原性ウイルスと戦う方法として紫外線照射の使用を検討する際には考慮されるべきである。

図2bに示されたデータは、UVCがSARS-CoV-2ウイルスに対して効果的である可能性があることを示唆する点と、効率的な不活化に必要な用量の点で、以前に発表された結果とよく一致しています（表3）。懸濁液中の SARS-CoV-2 ウイルスの不活化に関する以前に発表されたデータでは、3-log 減少に必要なより高い用量が示唆されていることは注目に値します (表 3、行 1、4、6、7、および 8 を比較)。タンパク質を懸濁液に加え8、紫外線吸収剤として機能します。懸濁液とエアロゾルを直接比較した場合 8、後者のウイルスの同様の活性化に必要な用量ははるかに低かったが (表 3 の 7 行目を参照)、これはおそらくエアロゾル中の液滴サイズがはるかに小さいため (参考文献 8 では 80% 以上)液滴のサイズは 1 μm 未満でしたが、ここで示したものと同様の体積を使用したことを考えると、懸濁液滴はおそらく約 1 mm でした)。

要約すると、我々の結果と以前の結果の両方は、UVC 照射が、消毒剤の使用による環境への影響を軽減しながらヒトのコロナウイルスと戦うために使用でき、呼吸用マスクの再利用を可能にし 9,18 、マスクから発生するプラスチック廃棄物を削減できることを示唆しています 19。さらに、消毒剤として UV を使用することにより、環境上問題となる化学消毒剤 20 や水銀含有 UV ランプの使用を削減できます (世界的な水銀汚染を削減するための水俣条約に沿って)。 UVC LED に必要な小型の UV-LED と単純な電気回路も、換気システムへの組み込みをサポートする可能性があります 21 が、そのような用途は UV-LED の発光効率によって依然として制限されています。

この研究では4つのSARS-CoV-2変異株が使用された：wt（2020年にイスラエルで流行したwt様株、B.1.1.50）。複数のスパイク変異を含むアルファ (B.1.1.7 501Y.V1) は、野生株よりも感染率が 70% 高いことが実証されました 13。デルタ（B.1.617.2）は、アルファ変異体と比較して感染力が高く、より重篤な疾患を引き起こすと報告されています13。および Omicron (B.1.1.529) は、スパイクタンパク質に 30 以上のアミノ酸変異を含み、他の変異体の変異率を 5 ～ 11 倍上回る変異率を示し、さらに伝達率と免疫回避が強化されています 14。すべてのウイルス変異体はマンデルバウム研究所で日常診断に使用された残りの呼吸器綿棒サンプル（完全に匿名化されたサンプル）から分離され、SARS-CoV-2陽性であることが判明した。すべてのプロトコルはシェバメディカルセンターヘルシンキ委員会の承認 (番号 7875-20-SMC) に基づいて実施され、このような状況では病院はインフォームドコンセントを必要としません。ウイルスは配列決定によって同定されました（配列はそれぞれアクセッション番号 OQ948263 ～ OQ948266 で NCBI ジーンバンクデータベースに寄託されています。配列は https://gisaid.org/ にもアクセッション番号 EPI_ISL_745046、EPI_ISL_737204、EPI_ISL_2183060 および EPI_ISL_786919 で見つかります）それぞれ7）。ウイルスの伝播は前述のとおりです15。

UV 源は、AquiSense と共同で構築されたカスタムメイドの UV-LED デバイスで、ピーク発光波長は 267 nm でした (図 1)1,16。加重入射放射照度は、露光領域の中心で 0.152 mW/cm2 でした (コサイン補正器を備え、250 ～ 290 nm に統合された校正済みの Ocean Optics USB4000 分光放射計で測定)。ＵＶ線量（ｍＪ／ｃｍ２）は、測定された照射量（ｍＷ／ｃｍ２）に照射時間（秒）を乗じて求めた。

ウイルス照射は前述のように行われました1。簡単に説明すると、ウイルス懸濁液を、フェノールレッドを含まないイーグル最小必須培地（UVT > 95%）で 10 × 100TCID50 の濃度（つまり、細胞培養中の細胞の 50% に感染するのに必要なウイルスの 1000 倍希釈 22）まで希釈しました。ここでは感染から5日以内）。このウイルス懸濁液 50 μl を黒色の 24 ウェルプレートの各ウェルに配置しました (最高点で約 1 mm の高さの層が得られます)。すべてのウェルを黒色の絶縁テープで覆った。照射前に毎回、指定された時間、テープを 4 ウェル列または 6 ウェル列から取り外しました 1,16。したがって、プレートあたり 4 または 6 回の複製が行われました。試験した各プレートでは、照射中ずっとウェルの列/行を覆ったままにして、UVなし対照および放射照度0の基準として機能させました。結果に大きなばらつきがあったため、短い照射時間 (1、2、および 5 mJ/cm2) ではこのプロセスを 3 回繰り返しました。ゼロ照射コントロールは、他の効果を考慮して、照射プロセス全体を通じてテープで覆われたままでした。

ウイルスの定量化は増殖後に行われるため、感染力のあるウイルスのみが定量化されます。この目的を達成するために、照射後、2% (v/v) ウシ胎児血清 (MEM-EAGLE) を添加したイーグル最小必須培地 450 μl を各ウェル (「UV なし」ウェルを含む) に添加しました。内容物をピペッティングで混合し、同じ培地に 24 時間経過 (コンフルエンシー 80 ～ 90%) した Vero-E6 細胞を含む 96 ウェルプレート (Applied Biosystems、米国) のウェルに 50 μl を移し、最終的なウェルあたりウイルス濃度 100TCID50 (照射前ウイルスの場合)。プレートを33℃で1時間インキュベートし、付着していないウイルスをピペッティングにより培地で洗浄し、2%FCSを含む200μLのMEM-EAGLE培地を添加した。次に細胞を、5% CO2、33 °C の加湿インキュベーター内でさらに 5 日間インキュベートしました。メーカーのプロトコールに従って、MagNA Pure 96 Instrument (Roche Life Science) を使用して細胞から全 RNA を抽出しました。細胞内のウイルスのコピー数を逆転写酵素 qPCR (CFX-96 サーモサイクラー、Bio-Rad、米国で実施) によって決定し、既知の力価のウイルス溶液から構築した検量線と比較しました。使用したオリゴヌクレオチドは E_Sarbeco_F (ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT) および E_Sarbeco_R (ATATTGCAGCAGTACGCACACA) であり、プローブは E_Sarbeco_P1(FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ) であり、条件は参考文献 23 に記載されています。

対数不活化は、変異体と調製物の組み合わせごとに対数 (N0/N) として個別に計算されました。N と N0 はそれぞれ、照射ありとなしのウイルス濃度であり、初期ウイルス数のばらつきを補正します (同じ変異体の異なる調製物と間の両方)同じ準備日のバリエーション)。この目的のために、各ウェル内のウイルス数（式 1、Ndose バリアント）を、同じプレート内の対応する平均特異的バリアント noUV ウェルのウイルスの平均数（式 1、N0 バリアント）で割りました。

すべての分析は、タイプ III 平方和を使用した Windows v.24 (IBM、2016 年リリース) の SPSS 統計を使用して行われました。

UV 感受性モチーフの定量化は、カスタムコードを使用して R (バージョン 4.1.3; 2022-03-10) で行われました (補足情報を参照)。配列比較は MAFFT アルゴリズム (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/) を使用して行われ、アラインメントは Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/) を使用して行われました。クラスタロ/)。

この研究は、オラニム・アカデミック・カレッジの内部助成金とテルアビブ大学パンデミック対策センター（TCCP）から一部資金提供を受けました。

この研究で使用されたバリアントの配列は、登録番号 OQ948263 (wt)、OQ948264 (Alpha)、OQ948265 (Delta)、OQ948266 (Omicron) で NCBI ジーンバンクデータベースに寄託されました。配列は https でも見つけることができます。 ://gisaid.org/ (それぞれ、アクセッション番号 EPI_ISL_745046、EPI_ISL_737204、EPI_ISL_2183060、および EPI_ISL_7869197) https://gisaid.org/ (アクセッション番号 EPI_ISL_745046 (wt)、EPI_ISL_737204 (Alpha)、EPI_ISL_21) 83060 (デルタ) および EPI_ISL_7869197 (オミクロン) 。

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この研究は、テルアビブ大学パンデミック対策センター https://en-pandemics.tau.ac.il/ (HM) とオラニム大学の内部助成金 (YG) によって部分的に資金提供されました。

ミハル・マンデルボイムとヨラム・ガーチマンという著者も同様に貢献しました。

中央ウイルス研究所、保健省、チャイム・シェバ医療センター、テル・ハショメル、ラマトガン、イスラエル

ノファー・アタリ、ネタ・ザッカーマン、ミハル・マンデルボイム

テルアビブ大学工学部機械工学部、69978、テルアビブ、イスラエル

マーマネの妖精たち

イスラエル、キリヤット・ティヴォン、ハイファ・オラニム大学自然科学部生物学・環境学科

アロン・シルバーブッシュ

テルアビブ大学公衆衛生学部疫学・予防医学科（イスラエル、テルアビブ）

ミハル・マンデルボイム

ハイファ大学進化研究所（イスラエル、ハイファ）

ヨラム・ガーチマン

Oranim College、3600600、ティヴォン、イスラエル

ヨラム・ガーチマン

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NA 事前に行われた実験と収集されたデータ、原稿のレビュー。 HM 資金確保、原稿レビュー。 AS 統計分析と原稿レビューを実施しました。 NZ バイオインフォマティック配列解析、原稿レビューを実施。 MM は分析を考案および設計し、実験の監督と原稿のレビューを行いました。 YG は分析を考案、設計し、資金を確保し、初稿を書き、原稿のレビューを行いました。

ヨラム・ガーチマンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Atari、N.、Mamane、H.、Silberbush、A. 他。 UV-LED 267 nm による SARS-CoV-2 の消毒: さまざまな変異体の比較。 Sci Rep 13、8229 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35247-9

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受信日: 2022 年 9 月 23 日

受理日: 2023 年 5 月 15 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35247-9

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